李宝平，邢万红，路鹏雁，张 雷，马 捷
山西医科大学第二医院心胸外科，山西省太原市 030001
李宝平★，男，1964年生，山西省太原市人，汉族，1989年山西医科大学毕业，硕士，教授，主要从事肺减容和肿瘤综合治疗方面的研究。
libaopingmd@163.com
Influence of growth factors and bone marrow mesenchymal stem cells on lung revascularization and restoration of smoking-induced emophysematous model in rats
Li Bao-ping, Xing Wan-hong, Lu Peng-yan, Zhang Lei, Ma Jie
Department of Cardiothoracic Surgery, The Second Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China
Li Bao-ping★, Master, Professor, Department of Cardiothoracic Surgery, The Second Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China
libaopingmd@163.com
Abstract
BACKGROUND: Preliminary study has proved that the bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) in a rat emphysema model produced by use of trypsin alone can "homing" to the lesioned lung tissues, and participate in the formation of pulmonary arteries to promote lung tissue repair. Basic fibroblast growth factor (bFGF) and vascular endothelial growth factor (VEGF) play equally a powerful role in promoting angiogenesis.
OBJECTIVE: To observe the influence of bFGF, VEGF and MSCs in regeneration of pulmonary capillary and pathological repair of pulmonary emphysema rats.
METHODS: Except normal control group, the remaining 5 groups of rats were exposed to tobacco smoke and received a single intratracheally instillation of porcine pancreatic elastase to induce emphysema models. Following successful modeling, rats of bFGF group were intratracheally injected with 400 U bFGF and rats of VEGF group with 2 μg VEGF, once a week for three times. MSCs group was injected 1 mL suspension of 4×109/L MSCs into tail vein. MSCs+VEGF group was injected MSCs into tail vein and intratracheally injected VEGF (2 ug, three times) at the same time. Model control and normal control groups were intratracheally injected with equal volume of sodium chloride. Four weeks after treatment, arterial blood gas analysis was performed to observe pathological and morphological changes of lung tissues. CD34+ expression in lung tissues was determined using immunohistochemistry method.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with model control group, PaO2 values dramatically increased in VEGF group (P < 0.05), while other indices remained unchanged (P > 0.05); there were no obvious changes in each index in other groups (P > 0.05). Gross and microscopic observations showed that, lung was smooth, pale pink, and elastic in normal control group, with uniform size of pulmonary alveoli on cross-section; pathological changes of chronic obstructive pulmonary emphysema existed in model control group, but improved in other 4 groups. Compared with model control group, mean pulmonary alveoli number and CD34+ relative positive area dramatically increased in bFGF, VEGF, MSCs, MSCs+VEGF groups (P < 0.05), mean linear intercept and mean alveoli area were significantly reduced (P < 0.05). No significant difference was observed in each index among these 4 groups (P > 0.05). bFGF, VEGF and MSCs could improved the pathology of pulmonary emphysema models produced by tobacco smoking and intratracheally instillation of porcine pancreatic elastase. The possible mechanism of recovering the pulmonary emphysema is the proliferation of pulmonary capillary and enlargement of pulmonary artery, improved blood flow in the lung, improved ventilation/perfusion shunt, reduced pulmonary alveolus size and volume of the lung through self-compensation.
Li BP, Xing WH, Lu PY, Zhang L, Ma J. Influence of growth factors and bone marrow mesenchymal stem cells on lung revascularization and restoration of smoking-induced emophysematous model in rats.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2010;14(2): 227-232. [http://www.crter.cn http://en.zglckf.com]
摘要
背景：作者以往研究初步证明在单纯使用胰蛋白酶制作的大鼠肺气肿模型上骨髓间充质干细胞可以“归巢”到病损肺组织，并参与肺血管形成促进肺组织修复。碱性成纤维生长因子、血管内皮生长因子同样具有强大的促进血管新生的作用。
目的：观察碱性成纤维生长因子、血管内皮生长因子、骨髓间充质干细胞对肺气肿模型大鼠肺毛细血管再生和肺气肿病理修复的影响。
方法：除正常对照组外，其余5组大鼠均采用烟熏加气管内一次性滴注猪胰弹性蛋白酶法建立肺气肿模型。成功造模后，碱性成纤维细胞生长因子组气管内注入400 U碱性成纤维细胞生长因子，血管内皮生长因子组气管内注入2 μg血管内皮生长因子，1次/周，共3次；单纯细胞移植组于尾静脉注入4×109 L-1骨髓间充质干细胞悬液1 mL；血管内皮生长因子+细胞移植组气管内注入血管内皮生长因子的同时，尾静脉注入骨髓间充质干细胞；模型对照组、正常对照组给予相同体积的生理盐水。干预4周后行动脉血气分析，观察肺组织病理改变及形态学指标变化，免疫组化法检测肺组织CD34+的表达。
结果与结论：与模型对照组比较，血管内皮生长因子组PaO2值明显升高(P < 0.05)，余指标无明显变化(P > 0.05)；其余组各项指标均无明显变化(P > 0.05)。大体及光镜观察可见，正常对照组肺表面光滑平整，呈淡粉红色，弹性好，切面可见肺泡大小均匀一致；模型对照组出现慢性阻塞性肺气肿病理改变；余4组均较模型对照组病变程度有所好转。与模型对照组比较，碱性成纤维细胞生长因子组、血管内皮生长因子组、单纯细胞移植组、血管内皮生长因子+细胞移植组平均肺泡数、CD34+相对阳性面积均明显增加(P < 0.05)，平均肺泡面积、平均内衬间隔则明显减少(P < 0.05)，此4组之间各指标比较均无明显差异(P > 0.05)。提示碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、骨髓间充质干细胞均能在一定程度上修复烟熏加气管内滴入弹性蛋白酶构建的大鼠肺气肿模型的病变，可能的作用机制是增加肺的毛细血管数、扩张肺血管，增加肺血流量，改善通气/血流，肺组织通过自身的代偿缩小了肺泡面积，减小肺容积。
关键词：肺再血管化；肺气肿；碱性成纤维细胞生长因子；血管内皮生长因子；骨髓间充质干细胞；心肺组织工程
doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.02.009
李宝平，邢万红，路鹏雁，张雷，马捷. 生长因子及骨髓间充质干细胞与肺再血管化修复烟熏大鼠肺气肿模型[J].中国组织工程研究与临床康复，2010，14(2):227-232. [http://www.crter.org http://cn.zglckf.com]
0 引言
慢性阻塞性肺疾病是一种严重威胁人类健康的呼吸系统疾病中的常见病和多发病，而阻塞性肺气肿是慢性阻塞性肺疾病主要的病理改变之一。众所周知，引起肺气肿发生的原因包括吸烟、大气污染、感染和弹性蛋白酶/抗弹性蛋白酶失衡等，而吸烟排在第一位，是导致慢性阻塞性肺疾患的最重要因素。吸烟与肺气肿的关系密切，有研究表明尼古丁、香烟提取物可引起明显的血管收缩。给猪肌肉注射尼古丁后，发现外科皮瓣的毛细血管的血流量明显减少[1]。长期吸烟者上肢血管内皮细胞释放内皮源性舒张因子明显减少；短期吸烟者增强血管收缩药物的缩血管作用[2]。既然烟雾中的有害成分对血管内皮有损伤作用，可以收缩血管，那么在吸烟的过程中烟雾对肺脏的毛细血管的损害应该是首当其冲的。
按照上述假设，肺血流量越少的部位肺气肿病变会越重。由于正常状态下肺上部通气/血流比本身就大，血流若进一步减少后，通气/血流比会更进一步增大，因此肺上部应该更容易产生肺气肿病变。所以，肺气肿病变在肺内分布应该是不均匀的，双肺上叶的病变应较下叶为重，而上叶中应以肺尖部为著，有意义的是基于上述假设的理论推测，与临床上所观察到的肺气肿病变在肺内分布的普遍现象完全吻合。在所提出的假设和前期研究的基础上，实验首先建立烟熏加气管内滴入弹性蛋白水解酶复制大鼠肺气肿动物模型，然后用碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子和骨髓间充质干细胞干预肺气肿大鼠，观察其对血气和肺泡形态学的影响，并进一步检测其对毛细血管的影响。
1 材料和方法
设计：随机对照动物实验。
时间及地点：于2007-04/2008-04在山西医科大学生理实验室完成。
材料：
实验动物及分组：健康8周龄Wistar大鼠48只，雌雄不限，体质量180~200 g，随机分为6组：碱性成纤维细胞生长因子组、血管内皮生长因子组、单纯细胞移植组、血管内皮生长因子+细胞移植组、模型对照组、正常对照组，8只/组。另取健康4周龄Wistar大鼠1只，体质量约90 g，用于制备骨髓间充质干细胞。动物均由山西医科大学生理实验动物中心提供，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。
实验用主要材料：
实验方法：
大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养：取4周龄健康Wistar大鼠，断颈法处死，用体积分数为75%的乙醇浸泡10 min，无菌操作台中剪开下肢皮肤，无菌分离股骨胫骨，放入无菌培养皿中，咬骨钳剪去股骨和胫骨两骨端，注射器抽吸体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液，将骨髓冲入10 mL的离心管中，吸管吹打，充分混匀细胞悬液。将密度1.077 g/mL的淋巴细胞分离液先置于试管底部，然后按1∶1比例将稀释的骨髓液缓慢叠加于离心管中。2 000 r/min离心15 min，收集单个核细胞层(中间层)，PBS洗涤，1500 r/min离心15 min。弃上清，收集沉淀，PBS重复洗涤1次，用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液将细胞重悬。以1×108 L-1密度接种于培养瓶中，于37 ℃、含体积分数5%的CO2培养箱中孵育。72 h后首次换液，以后每3 d换液1次。倒置相差显微镜观察细胞形态学，1次/d。细胞生长密度达80%~90%接近汇合时，进行细胞传代，2.5 g/L胰蛋白酶消化，以1∶2比例进行传代，并按此方法逐代扩增。
骨髓间充质干细胞的标记：已传2代的细胞，在培养液中加入BrdU，终浓度为10 μmol/L，孵育48 h为最佳时间，将细胞用2.5 g/L胰酶消化3.0~4.0 min后，加入血清1∶1终止消化，收集培养液于离心管中，1 000 r/min离心5 min，弃上清。用PBS将细胞重悬，制成单细胞悬液，浓度为4.0×109 L-1。
肺气肿模型的建立：除正常对照组外，其余5组大鼠均采用烟熏加气管内一次性滴注猪胰弹性蛋白酶法建立肺气肿模型。将大鼠放入自制实验性被动吸烟装置，每次点燃香烟10支，40 min/次，1次/d，每周被动吸烟 6 d，1个月后用10%水合氯醛以0.3 mL/100 g的剂量腹腔注射麻醉，固定于自制的实验台上，使大鼠头后仰70°左右，LED台灯照射颈部，镊子夹出大鼠舌头，将静脉留置针的塑料套管插入气管，滴入猪胰弹性蛋白酶 50 U/100 g配成的0.5 mL生理盐水，滴完后注入少量空气以保证全部药液进入气管，将鼠竖起并适度摇动使药液分布尽可能均匀，注意保温，待大鼠清醒后放回鼠笼中，继续烟熏至3个月，模型制作成功。正常对照组大鼠于1个月后气管内滴注生理盐水，饲养至3个月。
肺气肿模型的药物干预：成功造模后，碱性成纤维细胞生长因子组气管内注入400 U碱性成纤维细胞生长因子，血管内皮生长因子组气管内注入2 μg血管内皮生长因子，1次/周，共3次；单纯细胞移植组于尾静脉注入4×109 L-1骨髓间充质干细胞悬液1 mL；血管内皮生长因子+细胞移植组气管内注入血管内皮生长因子的同时，尾静脉注入骨髓间充质干细胞；模型对照组、正常对照组给予相同体积的生理盐水。4周后测动脉血气，取肺组织作病理切片，观察肺泡变化，并计算平均肺泡数、平均肺泡面积、平均内衬间隔。
计算方法：
平均内衬间隔：
以每个视野正中为中心划“十”字交叉线，计数经此十字线的肺泡间隔数(Ns)。测出十字线总长度(L)，以平均内衬间隔=L/Ns得到平均内衬间隔。
平均肺泡数：
计数每个视野内的肺泡数(Na)，及观察视野数(N)。以平均肺泡数=Na/N计算各个视野的平均肺泡数。
平均肺泡面积：
计数每个视野内的肺泡数(Na)，测出每个视野的总面积(TA)和苏木精-伊红染色阳性区域(肺间质)的面积(PA)，以平均肺泡面积=(TA-PA)/Na计算每个视野的平均肺泡面积。
动脉血气分析：将大鼠用体积分数为10%水合氯醛腹腔注射麻醉(3 μL/g)，仰卧固定于实验台上，剪开腹壁，翻转腹腔脏器暴露腹主动脉，1 mL注射器(肝素冲洗)采血0.4 mL行动脉血气分析。
肺组织取材：大鼠腹主动脉放血取材，剪断肋骨入胸，暴露气管、肺脏和心脏，切断主支气管，用弯钳将其提起，沿脊柱前方分离，将心脏和肺脏一起分离，剪去心脏。在2.45 kPa压力下经气管灌注体积分数为10%中性甲醛溶液固定肺脏，直至肺完全膨胀、胸膜展平、边缘锐利，维持30 min，结扎气管，浸入体积分数为10%中性甲醛溶液中，固定48 h，常规石蜡包埋，切片，每只大鼠各取双侧肺最大横径处肺组织。苏木精-伊红染色，行肺组织病理学观察、形态学测定以及抗CD34免疫组织化学测定。
肺组织病理学观察：大体观察肺脏大小，色泽等；光学显微镜观察脏层胸膜下和小支气管周围肺泡的形态结构及支气管、血管黏膜下和肺泡炎性细胞浸润。
肺组织形态学测定：在光学显微镜下10×10采集图像，用计算机彩色图像处理系统测量。每只大鼠观测4张肺切片，每张切片随机选择10个视野，测量时避开支气管及大、中血管。
标本抗CD34免疫组织化学和抗BrdU免疫组织化学测定：显微镜下，棕黄色的扁平细胞即为毛细血管内皮细胞；荧光显微镜下，发红色荧光的为骨髓间充质干细胞。
设计、实施、评估者：设计为第一作者，实施与评估为全部作者，均经过系统培训，未使用盲法评估。
统计学分析：计量资料均以x(_)±s表示，由第一作者使用SPSS 11.5 for windows进行数据处理，多组间比较采用单因素方差分析，方差分析有统计学差异时进一步用 SNK 法比较各组样本均值，P < 0.05为差异有显著性意义。
2 结果
2.1 动物一般情况 正常对照组大鼠进食正常，皮毛光滑，生长良好，无明显的呼吸道症状。其余5组大鼠饲养中出现皮毛干涩、皮癣、体质量增长减缓，有气促、流涕、打喷嚏等呼吸道症状。药物干预后，碱性成纤维细胞生长因子组、血管内皮生长因子组、单纯细胞移植组、血管内皮生长因子+细胞移植组较模型对照组稍有改善。
与正常对照组比较，实验后其余5组大鼠体质量均明显降低(P < 0.05)。与模型对照组比较，碱性成纤维细胞生长因子组、血管内皮生长因子组、单纯细胞移植组、血管内皮生长因子+细胞移植组大鼠体质量均明显升高(P < 0.05)，此4组之间比较无明显差异(P > 0.05)。
2.2 动脉血气分析结果 与正常对照组比较，碱性成纤维细胞生长因子组、血管内皮生长因子组、单纯细胞移植组、血管内皮生长因子+细胞移植组pH，PaO2，PCO2，SaO2值均无明显差异(P > 0.05)。与模型对照组比较，血管内皮生长因子组PaO2值明显升高(P < 0.05)，余指标无明显变化(P > 0.05)；其余组各项指标均无明显变化(P > 0.05)，见表1。
2.3 肺组织病理学观察
大体观察：正常对照组大鼠肺脏表面光滑平整，呈淡粉红色，质地较软，弹性好，指压后无压痕，切面可见肺泡大小均匀一致。模型对照组大鼠肺脏体积明显增大，过度膨胀，边缘钝圆，颜色苍白，弹性较差，指压后压痕不易消退，肺脏表面有多个大小不一的大泡，切面可见多量较大的肺泡腔，大小不一，形状不规则。余4组肺脏病变均较模型对照组轻。
光学显微镜观察：正常对照组肺泡数目多，大小均匀，间隔较完整，细支气管壁无明显炎症细胞。模型对照组肺泡壁变薄、肺泡腔扩大、破裂或形成大疱，毛细血管床明显减少，弹力纤维网破坏，肺泡结构紊乱，细支气管壁有炎症细胞浸润，呈肺气肿病理改变。余4组均较模型对照组病变好转，见图1。
2.4 肺组织抗CD34免疫组化结果 碱性成纤维细胞生长因子组、血管内皮生长因子组、单纯细胞移植组、血管内皮生长因子+细胞移植组、模型对照组、正常对照组的肺组织CD34+相对阳性面积分别为(3.63±0.94)%，(3.48±0.90)%，(2.78±0.76)%，(2.83± 0.74)%，(0.98±0.71)%，(5.28±0.62)%。
与正常对照组比较，余5组大鼠肺组织CD34+相对阳性面积均明显减少(P < 0.05)。与模型对照组比较，碱性成纤维细胞生长因子组、血管内皮生长因子组、单纯细胞移植组、血管内皮生长因子+细胞移植组肺组织CD34+相对阳性面积均明显增加(P < 0.05)，此4组之间比较均无明显差异(P > 0.05)，见图2。
2.5 肺组织形态学指标测定 见表2。
与正常对照组比较，余5组大鼠平均肺泡数均明显减少(P < 0.05)，平均肺泡面积、平均内衬间隔则明显增加(P < 0.05)。与模型对照组比较，碱性成纤维细胞生长因子组、血管内皮生长因子组、单纯细胞移植组、血管内皮生长因子+细胞移植组平均肺泡数明显增加 (P < 0.05)，平均肺泡面积、平均内衬间隔则明显减少 (P < 0.05)，此4组之间比较均无明显差异(P > 0.05)。
2.6 移植入大鼠体内的骨髓间充质干细胞BrdU示踪结果 骨髓间充质干细胞定居于肺组织内，荧光显微镜下发红色荧光的即为骨髓间充质干细胞，见图3。
3 讨论
目前肺气肿的发病机制和病理生理学的关键环节仍未阐明，肺气肿的发病过程一旦启动即表现为不可逆的进行性发展，目前尚无一种药物能够有效地逆转或阻止肺气肿的进行性发展过程[2]。常用且较为有效的外科治疗方法有肺大泡切除术、肺移植术和肺减容术。肺大泡切除术仅适用于少部分大泡性肺气肿患者，而肺移植因供体缺乏、手术适应证局限、机体排异反应、费用昂贵等因素尚不能推广。肺减容术经过多年的发展已成为肺气肿外科治疗的主要方法，但也只有约20%肺气肿患者能够得到治疗。因此，建立一种与人类吸烟所致肺气肿相似的实验动物模型有助于推动对该病的进一步研究。在生物医学的研究中，对小鼠基因组测序发现其基因组与人类基因组十分接近，而且目前许多啮齿类动物的检测指标均有商品化的抗体和探针，便于进行深入的细胞和分子生物学的研究。由于大鼠具有鼠的生物学特征，适合于有创操作的形体要求，被较多地用于肺气肿的治疗性干预研究中，因此实验选用大鼠作为实验动物。
实验性肺气肿动物模型的构建方法有多种，如促弹性蛋白分解酶类诱导的肺气肿模型、化学因素诱导的肺气肿、氯化镉诱导的肺气肿、内毒素和脂多糖诱导的肺气肿、吸烟诱导的肺气肿[3]以及基因相关肺气肿模型等。目前，大部分肺气肿的动物模型均采用气管滴入或雾化吸入蛋白酶的方法制作，但该法是蛋白酶直接造成周边肺组织肺泡间隔的破坏而形成肺气肿，不能较好地反映吸烟所致肺气肿引起的肺内慢性炎症和气道重构的病理生理过程[4]。吸烟是人类肺气肿发病的主要原因，香烟烟雾的刺激能较好地模拟人类肺气肿的发病过程，因此采用长期烟雾吸入刺激引发的实验动物肺气肿是最理想的肺气肿动物模型，但存在实验周期长、动物个体差异较大等缺点，广泛应用于实验研究有困难。Nikula等[5]也认为吸烟诱发肺气肿动物模型的周期长，需4~13个月，而且在不同动物中稳定性较差，因此采用单纯烟熏方法诱发动物肺气肿在实验时间和实验结果上均极难控制。文献报告一次性气管内滴入高浓度或大剂量的蛋白水解酶易造成肺内大量组织破坏和出血引起气道阻塞导致动物窒息死亡[6]。研究表明，采用烟熏加气管内滴入猪胰弹性蛋白酶的方法可以成功制作大鼠肺气肿模型[7]，在相对较短的时间内稳定地诱发类似于人类长期吸烟所致肺气肿的动物模型。因此，实验采用烟熏加气管内滴入猪胰弹性蛋白酶的方法复制大鼠肺气肿模型。实验结果显示，呼吸性细支气管、肺泡管、肺泡囊、肺泡明显扩大，肺泡壁变薄、断裂，有的融合成肺大泡，形成明显中度全小叶型肺气肿，组织形态学测定等显示符合肺气肿特征。
目前认为肺气肿发病是多种因素协同作用形成的，归纳其发生机制为：炎症反应，酶学失衡，气流受限，基质金属蛋白，氧化应激，细胞凋亡等。研究认为肺气肿是一种不可逆转的进展性疾病。但也有资料表明，肺泡在特定环境和条件的刺激下可出现代偿性生长甚至再生[8]。有研究表明，生长因子在啮齿类动物和人类肺的发育中扮演重要的角色[9]，在小鼠[10]、大鼠和犬等动物实验表明[11]，一侧肺叶或全肺切除能够引起健侧肺代偿性生长，表现为肺内HIMF，EPOR和EGF等多种生长因子的表达上调，肺内蛋白和DNA合成增加，胶原和弹性蛋白聚集，肺泡间隔和肺泡数量增多，肺的质量增加，部分动物肺功能改善。成人肺叶移植入未成年人体内后也会出现肺的代偿性生长[12]，Laros等[13]对在儿童或少年时期行一侧全肺切除后长达30余年的观察发现肺出现了代偿性生长。以上研究表明人类肺组织在特定条件下也会出现代偿性生长。肺泡承受的牵张应力的增加可能是肺代偿性生长的主要原因[14]，LVRS术后相对正常的肺泡得到扩张，肺泡承受胸腔负压和呼吸应力的改变增加了肺气肿组织的血流量，可能引起了肺内相关基因如TEmRNA的表达上调，促进了肺泡的修复。但是在血供较少的组织和器官再生是很难发生的，肺血流量的恢复是肺泡再生不可缺少的条件。而且肺泡Ⅱ型上皮细胞可以自我复制和分化成Ⅰ型上皮细胞。Shigeyuki等[15]通过气管内给予碱性成纤维细胞生长因子治疗弹性蛋白酶诱导的狗肺气肿模型，发现经碱性成纤维细胞生长因子治疗后的肺气肿动物模型动脉血氧分压明显增高，肺血流明显增加，病理学观察平均肺泡内衬间隔明显减小。因此增加肺毛细血管数，增加肺血流量，改善通气/血流，是肺泡再生和自我修复必不可少的条件。
血管内皮生长因子是一种肝素结合的二聚体多肽糖蛋白，通过作用于血管内皮细胞的血管内皮生长因子受体而发挥刺激血管内皮细胞的增殖、迁移和体内血管的形成。碱性成纤维细胞生长因子是血管生长因子家族重要成员之一，体外研究发现在毛细血管中加入碱性成纤维细胞生长因子，不但可以促进细胞增殖、分裂和生长，还可以诱导毛细血管样管腔形成，同时发现对血管内皮细胞有强烈的趋化作用。体内研究发现碱性成纤维细胞生长因子有强烈的促血管形成作用。有研究表明，在大鼠胚胎肺发育过程中碱性成纤维细胞生长因子及其受体的表达主要定位于气道上皮细胞、基底膜和细胞外基质，是肺发育必不可少的因子之一[16]。骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能，而且具有趋化性和局部诱导性，可以分化成肺泡Ⅱ型细胞和肺泡前体细胞[17]。华平等[18]研究证明骨髓间充质干细胞可分化成血管内皮细胞，同时能分泌血管生成素配体和细胞因子，而且具有很强的趋化特性，即只分布在缺血梗死区，而在正常心肌内没有发现。
实验用碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子和骨髓间充质干细胞干预烟熏加弹性蛋白酶构建的大鼠肺气肿模型，结果发现与正常对照组相比，各治疗组平均肺泡数明显增加(P < 0.01)，平均内衬间隔、平均肺泡面积均明显减少(P < 0.01)；免疫组织化学检测发现，治疗后的肺气肿大鼠肺组织CD34+阳性面积明显增加。CD34是内皮细胞表面的抗原，CD34+细胞明显增加，说明内皮细胞数明显增加，即肺毛细血管数明显增加了。动脉血气分析结果表明，血管内皮生长因子组动脉氧分压高于模型对照组(P < 0.05)。
总之，碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子和骨髓间充质干细胞可能是通过促进肺血管再生，增加肺毛细血管数，增加肺血流量，改善肺的通气/血流比值，一定程度上修复肺气肿的病理改变，从而间接验证开篇假设，即“肺气肿的产生也有可能是有害因素(如烟草的有害成分、感染的炎性递质等)首先损伤肺泡毛细血管，致使肺的毛细血管床减少，肺血流量即减少，肺通气/血流比增大，即生理死腔增大。为减少生理死腔，机体代偿性地出现：①细小支气管收缩以减少通气量。②肺泡融合以减少肺泡表面积，从而减少气体弥散面积，使失衡的通气/血流比得以重新匹配，可是也由此产生了小气道狭窄、肺泡扩张融合成囊腔等的肺气肿的病理改变”。
4 参考文献
[1] Forrest CR, Xu N, Pang CY.Evidence for nicotine-induced skin flap ischemic necrosis in the pig. Can physiolphorm acol.1994; 72(1):30-38.
[2] Fiowski W, Linder L, Stoschitzky K,et al.Diminished vascular response to exogenously administered endothelin-1 in clinically healthy smoker. Circulation.1994;90(1):27-34.
[3] Christensen PJ, Preston AM, Ling T, et al.Pneumocystis murina infection and cigarette smoke exposure interact to cause increased organism burden, development of airspace enlargement, and pulmonary inflammation in mice.Infect Immun. 2008;76(8):3481-3490.
[4] Thébaud B, Abman SH. Bronchopulmonary dysplasia: where have all the vessels gone? Roles of angiogenic growth factors in chronic lung disease.Am J Respir Crit Care Med.2007;175(10): 978-985.
[5] Liebow AA. Pulmonary emphysema with special reference to vascular changes.Am Rev Respir Dis.1959;80(1):67-93.
[6] Shrager JB, Kim DK, Hashmi YJ,et al.Lung volume reduction surgery restores the normal diaphragmatic length tension relationship in emphysematous rats.J Thorac Cardiovasc Surg. 2001;121(2):217-224.
[7] Tan QY,Gong TQ,Li DL,et al.Disan Junyi Daxue Xuebao. 2004; 19(26):1788-1789.
谭群友, 龚太乾, 李东亮,等.烟雾和弹性蛋白酶诱导大鼠肺气肿模型的实验研究[J].第三军医大学学报,2004,19(26):1788-1789.
[8] American Thoracic Society ad hoc Statement Committee. Mechanisms and limits of induced postnatal lung growth. Am J Respir Crit Care Med.2004; 170(3):319-343.
[9] Selman M, Cisneros-Lira J, Gaxiola M,et al.Matrix metalloproteinases inhibition attenuates tobacco smoke-induced emphysema in guinea pigs. Chest.2003; 123（5）:1633-1641.
[10] Voswinckel R, Motejl V, Fehrenbach A, et al. Characterisation of post-pneumonectomy lung growth in adult mice. Eur Respir J. 2004; 24(4):524-532.
[11] Koh DW, Roby JD, Starcher B,et al.Postpneumonectomy lung growth: a model of reinitiation of tropoelastin and type I collagen production in a normal pattern in adult rat lung. Am J Respir Cell Mol Biol.1996; 15(5):611-623.
[12] Kaza AK, Cope JT, Fiser SM,et al.Contrasting natures of lung growth after transplantation and lobectomy. J Thorac Cardiovasc Surg.2002; 123(2):288-294.
[13] 1Laros CD, Westermann CJ. Dilatation, compensatory growth, or both after pneumonectomy during childhood and adolescence. A thirty-year follow-up study. J Thorac Cardiovasc Surg.1987; 93(4): 570-576.
[14] Rannels DE. Role of physical forces in compensatory growth of the lung. Am J Physiol.1989; 257(4 Pt 1):L179-L189.
[15] Shigeyuki M, Nakamura T, Toba T, et al. Fibroblast Growth Factor-2 Induces Recovery of Pulmonary Blood Flow in Canine Emphysema Models. Chest.2005; 128(2): 920-926.
[16] Ambalavanan N, Novak ZE. Peptide growth factors in tracheal aspirates of mechanically ventilated preterm neonates. Pediatr Res.2003; 53(2):240-244.
[17] Mattsson J, Jansson M, Wernerson A, et al. Lung epithelial cells and type II pneumocytes of donor origin after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation.Transplantation. 2004; 78(1):154-157.
[18] Hua P,Xiong LH,Zhang H,et al.Zhonghua Xianwei Waike Zazhi. 2004; 2(27):117-120.
华平,熊利华,张华,等.骨髓间充质干细胞移植重建大鼠缺血心肌的实验研究[J].中华显微外科杂志,2004,2(27):117-120.
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实验设计与文章构思：实验在利用更接近人类肺气肿发病机制的烟熏法制作了大鼠气肿模型，并进一步证实采用碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、骨髓间充质干细胞能促进肺血管形成，一定程度上修复肺气肿病变及改善肺功能。将肺毛细血管作为肺气肿治疗的新靶点，与其他有关肺气肿治疗研究的文章相比，方法更方便实施，并取得更好的治疗效果。
在试验中尽管碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、骨髓间充质干细胞等都通过促进血管形成、改善肺血流量达到修复肺气肿病变的目的，且骨髓间充质干细胞可以“归巢”肺病损部位，但骨髓间充质干细胞是否分化为血管内皮或有其他修复机制参与仍未明确；重组细胞因子半衰期较短，外用生物活性低，不易反复用药等都是需要深入分析的。