于海泉1，冯文岭2，田玉良1
1石家庄市中心医院骨三科，河北省石家庄市 050011；2河北医科大学第三医院骨伤科，河北省石家庄市 050051
于海泉★，男，1976年生，河北省清河县人，2008年河北医科大学毕业，硕士，主治医师，主要从事创伤骨科研究。
yufei318_2002@163.com
通讯作者：冯文岭，教授，硕士生导师，河北医科大学附属第三医院骨伤科，河北省石家庄市 050051
quandongwei@hotmail.com
Prevention of bone infection using calcium alginate gel compound vancomycin: Do administration routes influence pharmacological action?
Yu Hai-quan1, Feng Wen-ling2, Tian Yu-liang1
1Third Department of Orthopaedics, Shijiazhuang Central Hospital, Shijiazhuang 050011, Hebei Province, China; 2Department of Orthopaedics and Traumatology, Third Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050051, Hebei Province, China
Yu Hai-quan★, Master, Attending physician, Third Department of Orthopaedics, Shijiazhuang Central Hospital, Shijiazhuang 050011, Hebei Province, China
yufei318_2002@163.com
Correspondence to: Feng Wen-ling, Professor, Master’s supervisor, Department of Orthopaedics and Traumatology, Third Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050051, Hebei Province, China
quandongwei@hotmail.com
Abstract
BACKGROUND: Systemic administrations are widely used in preventing or curing bone infections, however, it accompanied by great adverse reactions and limited local blood drug levels. Therefore, local administration becomes a research focus, which aimed to explore a carrier possess good biocompatibility and slow-release antibiotics.
OBJECTIVE: To explore the effect of calcium alginate gel compound vancomycin on prevention of bone infection, simultaneously, single drug was injected or implanted into models to compare the results.
METHODS: A total of 60 healthy adult New Zealand white rabbits were prepared for osteomyelitis models by injecting Staphylococcus aureus to right tibiae medullaris, and randomly divided into systemic treatment, tricalcium phosphate and calcium alginate gel groups. After model preparation, rabbits in the systemic treatment group were intramuscular injected vancomycin (0.03 g, twice per day, for 4 successive days); in the tricalcium phosphate group, 1 g tricalcium phosphate combined with 0.1 g vancomycin was filled in the defects, sealed with bone wax. In the calcium alginate gel group, calcium alginate gel combined with vancomycin was implanted. Gross observation, radiological image and histological analysis were performed at weeks 4 and 8 after operation.
RESULTS AND CONCLUSION: Local swelling and partial sinus were found in the systemic treatment and tricalcium phosphate groups after operation. The pathological slice showed that there were a large number of lymphocytes and some sequestrum in the systemic treatment and tricalcium phosphate groups. However, there was no manifestation of osteomyelitis in the calcium alginate gel group. The results suggested that calcium alginate gel compound vancomycin exhibit superior therapeutic effect on prevention of bone infection to local administration of calcium alginate gel combined with vancomycin or systemic application of vancomycin.
Yu HQ, Feng WL, Tian YL.Prevention of bone infection using calcium alginate gel compound vancomycin: Do administration routes influence pharmacological action? Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2010;14(3): 419-423. [http://www.crter.cn http://en.zglckf.com]
摘要
背景：目前对骨感染的预防及治疗往往为全身用药，局部清创后静点抗生素预防及治疗骨感染，但局部血药浓度有限，全身不良反应较大，因此局部用药成为目前研究热点，其研究重点是寻找一种生物相容性较好，又可缓慢释放抗生素的载体。
目的：探讨藻酸钙凝胶复合万古霉素预防骨感染的能力，同时以万古霉素肌肉注射及磷酸三钙复合万古霉素植入造模区进行对照。
方法：以60只健康成年新西兰白兔为实验对象，各组右侧胫骨采用胫骨髓腔注射金黄色葡萄球菌的方法诱导骨髓炎生成，造模后全身用药组给予肌注万古霉素(0.03 g，2次/d，共4 d)，磷酸三钙组放置1 g磷酸三钙与0.1 g万古霉素复合体填充于造模区，骨蜡封闭，缝合，藻酸钙凝胶组局部造模后放置万古霉素藻酸钙凝胶。分别于术后4，8周进行大体观察，放射影像，组织学分析。
结果与结论：术后全身用药组以及磷酸三钙组大部分出现局部肿胀，并出现局部窦道、渗出。全身用药组及磷酸三钙组病理切片见大量淋巴细胞以及部分死骨，并可见部分脓腔。藻酸钙凝胶组其组织学和大体观察均无骨髓炎表现。提示复合万古霉素藻酸钙凝胶预防骨感染效果优于局部给予磷酸三钙复合万古霉素以及全身应用万古霉素。
关键词：藻酸钙凝胶；万古霉素；预防；骨感染；缓慢释放；生物材料
doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.03.010
于海泉，冯文岭，田玉良.藻酸钙万古霉素凝胶预防骨感染：不同给药途径影响药效吗？[J].中国组织工程研究与临床康复，2010，14(3):419-423. [http://www.crter.org http://cn.zglckf.com]
0 引言
目前临床骨感染主要为开放性骨折引起，部分为骨科清洁手术后局部感染造成，早期应用足量、广谱、强效抗生素成为一项重要防治措施。由于全身用药具有严重毒副作用，且局部血药浓度有限，因此局部用药成为目前研究热点。
自从1980年Klemm首次局部应用庆大霉素/聚甲基丙烯酸甲酯珠链防治骨及软组织感染获得成功后[1]，人们逐渐对骨感染的预防有一个重要的认识。但骨水泥内抗生素的释放能力差，根据研究显示90%~95%链珠中的抗生素药物无法释放[2]。而且骨水泥无法生物降解，需要二次手术取出，增加了患者再次手术造成的身体痛苦以及经济负担，因此目前人们逐渐采用不需取出的载体。李云飞等[3]采用载万古霉素纳米羟基磷灰石人工骨对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌慢性骨髓炎兔骨缺损进行修复，通过大体观察、放射影像、细菌培养、病理解剖评价，结果证明了新型载药纳米羟基磷灰石疗效的可靠性，同时减少了二次手术造成的创伤。而袁志等[4]采用抗感染重组合异种骨Ⅰ期植骨能有效修复犬桡骨污染性节段性骨缺损，预防骨感染的同时增加了骨缺损的修复，为临床治疗潜在骨感染性骨缺损提供了一种新方法。
藻酸钙凝胶电镜扫描为三维网状结构，目前已在骨缺损以及作为体外细胞生存的培养基等方面获得了良好的实验支持[5-6]，除作为种子细胞的载体外，海藻酸钙凝胶作为口服药物的缓控释载体以及水溶性的载体均可延缓药物的释放[7-8]。因此实验以藻酸钙凝胶作为抗生素的载体，采用沈霖等[9]方法制备兔骨髓炎模型，将藻酸钙万古霉素凝胶植入造模区后进行大体观察，X射线片以及病理学分析，探讨藻酸钙凝胶复合万古霉素预防骨感染的能力，同时以万古霉素肌肉注射及磷酸三钙复合万古霉素植入造模区进行对照，通过对比术后大体观察，影像学以及病理观察，判断采用藻酸钙万古霉素凝胶预防骨感染的效果。
1 材料和方法
设计：随机对照动物实验。
时间及地点：于2006-10/2007-04在河北医科大学第三医院动物实验室完成。
材料：60只三四个月龄新西兰白兔，体质量2.5 kg左右，由河北医科大学动物中心提供。按随机分组原则，分为全身用药组、磷酸三钙组、藻酸钙凝胶组，每组20只。实验过程中对动物处置符合动物伦理学要求。
主要材料：
材料 来源
金黄色葡萄球菌 河北医科大学医学微生物室
海藻酸钠 大连水产养殖公司化工厂，
批号：19930306
万古霉素 华北制药集团公司
方法：
万古霉素藻酸钙凝胶的制备：100 mL贮存液中加入1.0 g高纯度的海藻酸钠，置于磁力搅拌器上，搅拌6 h至完全溶解。将配制好的溶液过0.22 μm的滤器，高压灭菌。0.1 g万古霉素放入藻酸钠溶液中，充分溶解，放置于长10 mm，直径3 mm的管状模具中。用注射器抽取葡萄糖酸钙0.5 mL，注射器针头伸入藻酸钠溶液底部，缓慢注入，并逐渐退出形成万古霉素藻酸钙凝胶。
磷酸三钙万古霉素复合体的制备：将磷酸三钙1 g与万古霉素粉0.1 g于无菌量杯中充分混和制成磷酸三钙万古霉素复合体。
手术方法：所有实验用兔采用速眠灵 (0.2 mL/kg)局部肌肉注射麻醉成功后，仰卧位固定于兔专用手术台上，右下肢膝关节周围剃毛，聚维酮碘消毒手术野周围，铺无菌单。取右侧胫骨上方前内侧切开皮肤，长约1.5 cm，剥离骨膜，显露出胫骨上端前内侧(相当于干骺端)，以2.0 mm克氏针钻孔，上下共钻3个，共长约1.0 cm，以咬骨钳修剪骨窗，约1 cm× 0.3 cm。给予5%鱼肝油酸钠0.2 mL局部注射后，注入5×106 cfu/mL金黄色葡萄球菌0.2 mL，全身用药组骨蜡封闭，缝合，术后给予肌注万古霉素(0.03 g肌注，2次/d，共4 d)。磷酸三钙组放置1 g磷酸三钙与0.1 g万古霉素复合体填充于造模区，骨蜡封闭，缝合。藻酸钙凝胶组局部造模后放置万古霉素藻酸钙凝胶，骨蜡封闭，缝合。磷酸三钙组及藻酸钙凝胶组均不另外给予抗生素。
大体观察：观察术后饮食及活动情况，切口及其周围有无红肿及渗出，有无窦道形成。
X射线检查：术后4周及8周，各组置于45 kV、50 mA、0.08 s条件下，固定投照距离(40 cm)拍摄右后肢正位X射线片，观察局部有无死骨形
成、骨质破坏、骨质增生以及软组织炎性包块影，用改良的Laurence评分分级法进行评分。
骨髓炎的Laurence’s评分标准：
严重程度 骨破坏 骨膜反应 病变范围
0 无 无 无
1 少量 少量 近1/4胫骨
2 明显斑点状 明显 近1/2胫骨
3 广泛斑片状 较广泛 近3/4胫骨
4 广泛骨破坏 大量 整个胫骨
组织学观察：各组术后4周、8周随机处死实验兔(每个时间点10只)，无菌取材，常规苏木精-伊红染色后进行组织学观察。观察内容包括骨组织有无骨膜反应、骨质增生、骨质破坏、死骨、显微脓肿及炎细胞浸润等情况。
主要观察指标：于术后4，8周对其进行大体观察，放射影像，组织学分析。
设计、实施、评估者：设计及实施为第一作者，评估为第二作者，另外第二作者参与设计，所有人员经过正规培训。
统计学分析：由第一作者采用SPSS 10.0进行数据处理，X射线评分采用单因素方差分析。P < 0.05为差异有显著性意义。
2 结果
2.1 大体观察 全身用药组术后第3天死亡1只，血液培养证实为菌血症，剩余19只有14只出现切口周围红肿，毛发生长稀疏，部分出现破溃(图1)。磷酸三钙组有9只出现局部红肿，部分出现破溃。藻酸钙凝胶组实验兔伤口均一期愈合，皮肤缝线2周自行脱落。
术后4周及8周取材，大体观察：全身用药组有18个标本，磷酸三钙组有10个标本剖面，胫骨近端大部分外观变形、明显膨大、表面粗糙，部分残留皮质骨缺损，腔内充满结缔肉芽组织或脓肿(以全身用药组较多)，其余标本未发现明显骨质增生、破坏，未见浓液。藻酸钙凝胶组未见脓性渗出，部分骨缺损较前明显减少。
2.2 X射线评分 术后4，8周各组标本X射线片Laurence分值：全身用药组>磷酸三钙组>藻酸钙凝胶组。全身用药组有明显骨质增生、骨质破坏、软组织包块影以及死骨形成等表现(图2)，而藻酸钙凝胶组无明显骨髓炎表现(图3)。
Laurence评分经统计学处理，P=0.000 1，显示各组间差异有非常显著性意义(表1)，说明采用万古霉素藻酸钙凝胶优于磷酸三钙复合抗生素局部用药，磷酸三钙复合抗生素局部应用优于全身用药。
2.3 组织学观察 术后8周，全身用药组大部分及磷酸三钙组部分可见大量淋巴细胞，部分中性粒细胞以及浆细胞。骨质大多有明显增生、破坏，坏死骨形成，皮质骨缺损有部分残留，髓腔内可见较大的含稠密脓液的脓肿。藻酸钙凝胶组内未见明显炎性细胞，可见纤维瘢痕组织，并于靠近骨质处见成骨细胞生长(图4~6)，说明全身用药组及磷酸三钙组呈现骨感染表现，藻酸钙凝胶组无炎症表现。
3 讨论
感染为目前外科医生面临的一个重大挑战，骨科手术由于其特殊性，其治疗的目的是固定肢体、获得无感染的骨骼愈合和功能的恢复，因此一旦出现感染，将会导致骨不愈合，影响功能，严重者甚至造成生命危险. 尽管外科无菌技术和抗生素应用已经得到很大发展，但是骨关节手术后感染率仍很高，特别是开放性骨关节损伤手术后感染率可高达20%[10]。Dellinger等[11]搜集了10万次手术，清洁伤口和清污手术伤口感染率分别为1.4%和6.3%，以上数据证明了目前临床上防止骨感染的紧迫性。为预防骨关节损伤(特别是开放性骨损伤)手术后感染，降低继发骨髓炎发生率，除需严格无菌操作及彻底清创外，传统上一般还需全身应用抗生素进行辅助预防，目前抗生素的应用为预防骨感染的重要辅助预防措施[12]。全身用药虽可在血液中达到较高浓度，但对于一些局部血循破坏较重的损伤，常不能在损伤局部达到有效的药物浓度，从而限制其有效的预防作用。为提高抗生素预防骨感染的能力，目前开始研究和应用局部缓释抗生素的用药方式，并取得一定的效果。特别是Klemm[1]首次局部应用庆大霉素/聚甲基丙烯酸甲酯珠链防治骨及软组织感染获得成功后，局部采用抗生素缓慢释放预防骨感染取得明显进步，另外采用局部给药后血清学和尿检示药物浓度较低，肾毒性和局部毒性很低[13]。因此目前研究重点为寻找一种不需要二次手术取出、生成时不产生热量的药物载体。
藻酸是一种从海藻中提取的带有二价阴离子的多糖，与带有二价阳离子的钙离子通过离子交联形成开放的网状藻酸钙离子水凝胶。具有以下特性：良好的细胞相容性、化学稳定性、低毒性、低致热源性、免疫反应性低、确定的孔隙率。因此目前作为组织工程载体广泛应用于骨与软骨修复方面[14-15]，并被广泛用做药物以及生物制剂载体[16-19]。由于药物在投放部位缓慢释放，使药物在病变组织中保持较高的浓度并维持较长时间，可明显提高药物疗效。对于感染部位，持续有效的抗生素浓度是杀死细菌的必要条件，Ueng分别于2000年，2004年通过试验证实：万古霉素可于藻酸钙凝胶中缓慢释放，体外释放时间可延长至9~17 d，动物试验测定抗生素可缓慢释放，最小抑菌浓度释放时间可达3周[20-21]。由上可见，采用藻酸钙凝胶作为药物载体与骨水泥相比除避免二次手术取出外，而且不产生热量，因此，绝大部分药物都可以用其作为载体，可针对不同细菌培养放置不同的药物，较骨水泥作为载体仅限于耐高温相比有了更大的进步。
本实验万古霉素肌肉注射组以及部分磷酸三钙复合万古霉素组均可见局部红肿，其中全身用药组感染率高达70%(包括死亡1只)，而采用藻酸钙万古霉素凝胶组感染率为0，显著低于全身用药及局部给予磷酸三钙万古霉素复合体，感染动物病理切片可见大量淋巴细胞，部分中性粒细胞以及浆细胞。骨质大多有明显增生、破坏，坏死骨形成，髓腔内可见较大的含稠密脓液的脓肿。采用藻酸钙万古霉素凝胶组切口愈合良好，病理切片可见少量新生骨组织生长。术后X射线片骨髓炎Laurence分值依全身用药组、磷酸三钙组、藻酸钙凝胶组顺序逐渐减小，全身用药组有明显骨质增生、骨质破坏、软组织包块影以及死骨形成等表现，而藻酸钙凝胶组无明显骨髓炎表现，显示3组间存在差异，藻酸钙凝胶组结果优于磷酸三钙组，磷酸三钙组优于全身用药组，充分说明藻酸钙复合抗生素局部应用可有效预防骨感染，磷酸三钙复合抗生素局部应用较全身应用抗生素具有一定的预防感染能力，但效果较藻酸钙万古霉素凝胶差。
因此，通过以上试验，复合万古霉素藻酸钙凝胶优于局部给予磷酸三钙复合万古霉素以及全身应用万古霉素，可预防骨感染的发生，为向临床推广提供理论基础。
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利益冲突：课题不存在利益冲突。
课题意义：目前骨髓炎治疗已由全身用药转向局部用药，而利用抗生素的缓慢释放预防及治疗骨髓炎已成为研究热点，并被多个专家及学者通过试验证实，目前研究重点是寻找一种可使药物缓慢释放，又不使药效降低的载体。藻酸钙为古洛糖醛酸和甘露糖醛酸形成的多聚糖，由于其具有良好的生物相容性，易成型，且无毒，无味，在临床多作为修复骨及软骨缺损的载体。课题组拟将藻酸钙复合抗生素用于预防及治疗骨髓炎，该实验成功后将为临床治疗潜在骨感染性骨缺损提供了一种新方法。
课题评估的“金标准”：对于骨感染的诊断目前一般依据体征+查体、X射线片，病理诊断是确诊骨感染的金标准，本课题采用随机分组对比，得出科学的结论。
设计或课题的偏倚与不足：课题设计制作的藻酸钙凝胶机械强度较差，对于有较多骨质缺损患者不能提供有效支撑，一般放置于不受力或少受力的部位；可以尝试与其他机械强度较好的支架材料联合使用，以增强其在植入部位的载荷能力。
提供临床借鉴的价值：目前对骨感染的预防及治疗往往为全身用药，局部清创后静点抗生素预防及治疗骨感染，但是局部药物浓度较低，全身不良反应较大，效果较差，现在逐渐从全身用药转移到局部用药上来，局部用药包括局部一次性抗生素冲洗，置管抗生素持续冲洗，以及应用骨水泥等载体来通过持续释放预防或治疗骨感染，但以上各种方法可能分别存在护理困难、需再次手术取出及药物释放不完全的缺点，寻找一种生物相容性较好，又可缓慢释放抗生素的载体成为研究重点。藻酸钙因其独特的生物相容性及具有良好的三维空间结构，成型时不放出热量，可被机体缓慢吸收等优点，目前被作为良好的载体广泛应用于修补骨缺损，软骨缺损等试验研究，作者根据藻酸钙凝胶的特殊性质设想复合抗生素来预防治疗骨感染，促进骨折愈合。