《中国组织工程研究与临床康复》杂志社2009年12月第50期发表了解放军第四军医大学西京医院全军骨科研究所王忻等作者的“大鼠松质骨中降钙素基因相关肽在脊髓损伤后的变化”一文，课题创新性地应用血生化与免疫组织化学相结合的方法，观察脊髓损伤后大鼠松质骨中神经多肽降钙素基因相关肽的变化，分析其在脊髓损伤后骨质疏松中的意义。

实验过程中的操作方法

脊髓损伤模型建立：动物麻醉后行T₁₀椎板切除，脊髓损伤组用锐刀横切脊髓，对照组则仅行椎板切除后止血缝合。术后于室温下分笼饲养，标准大鼠饲料，自由饮水、摄食。脊髓损伤组每6 h专人协助排尿排便1次。

标本采集：术后1，3，6 周两组分别随机取8只，于主动脉取血3 mL，离心取血清，-20 ℃冰箱保存用于生化测定。再麻醉后断颈处死大鼠，迅速取双侧股骨髁部于体积分数10%的中性甲醛中固定，16 h后在混合脱钙液中脱钙72 h。常规脱水、浸蜡后沿股骨纵轴进行包埋。每例标本做不连续的切片5张，厚度为5 μm，用于免疫组织化学染色。

指标测定：B-ALP采用美国METRA生物系统公司的ELISA 试剂盒测定，单位以U/L表示，检测最小值为0.7 U/L；sNTX采用美国的Ostex Inte- rnational 公司的ELISA 盒测定，单位以μmol/L BCE表示。免疫组织化学一抗为兔抗鼠CGRP单克隆抗体( Sigma 公司)，二抗以及显色系统为DAKOEnVison^TM system试剂盒(DAKO公司)，其余试剂均为国内分析纯产品。

图像分析：通过与计算机相连的显微镜采集到的免疫组织化学切片图像存入微机，用Photoshop8.0 图像处理软件进行分析。统计图像中所有提取出的阳性信号，计算平均灰度值，灰度值越小，阳性染色越强，表明免疫反应性越高。

作者认为

B-ALP 是成骨细胞的胞外酶，由于其来源于成骨细胞，排除肝、肾、肠等疾病影响，故成为反映成骨细胞活性和骨形成的特异及敏感指标，成骨细胞活性增强，则B-ALP分泌增加。国内刘红，廖二元等对665例年龄在20～80岁的中国妇女进行调查研究发现，B-ALP与年龄有显著相关性，在骨量减少及骨质疏松的患者中，B-ALP 迅速升高，预示其可以作为一种敏感的标志物来测定骨转换率。NTX是含有PYD 和DPD 的低相对分子质量肽，是Ⅰ型胶原交联末端肽，为总的N 端交联物。是骨降解后尿中出现的一种稳定最终产物。Garcia- Perez等研究发现NTX用于监测骨吸收变化方面是最敏感的指标。

Valentijn等对切除卵巢大鼠术后每天注射CGRP-a，证实CGRP可抑制破骨细胞的骨吸收作用。而CGRP对破骨细胞骨吸收的抑制作用，可能通过调节成骨细胞细胞因子的释放而间接调节。除了可对成熟的破骨细胞发生作用之外，CGRP还可抑制骨髓培养液中破骨细胞的发育，并通过抑制破骨细胞祖细胞的分化和生成对破骨细胞起作用。Kawase等证实每个成骨细胞有3 000～3 500个CGRP受体。组织化学实验也证实，CGRP与成骨细胞结合，促进成骨细胞分裂。Shih 等利用成年大鼠骨髓干细胞培养发现，CGRP 既能增加骨集落的形成数目，又可增加骨集落的大小。因而他们认为，CGRP可通过刺激干细胞有丝分裂或骨祖细胞分化来促进骨形成。Michelangeli等在不同种属骨源性成骨细胞培养中发现，CGRP可以明显刺激细胞内环磷酸腺苷的产生，而cAMP水平的高低则与成骨细胞分泌的活性有关。上述研究表明CGRP可作用于成骨、破骨细胞影响骨代谢，促进成骨细胞的分化及功能，抑制破骨样细胞的分化及骨的吸收作用。

提供实验操作者可借鉴的意义

选题设计与构思：以往研究认为脊髓损伤后肢体的失用是引起脊髓损伤后骨质疏松的根本原因。但有证据表明脊髓损伤后骨质疏松并非单纯的失用性骨质疏松，无应力刺激、神经损伤以及激素水平的改变均参与了骨质疏松的发生。实验即是对骨组织中降钙素基因相关肽肽能神经的免疫反应性的变化半定量分析及在骨质疏松各个阶段中的变化，了解降钙素基因相关肽肽能神经在脊髓损伤后骨质疏松发生中可能的作用。

同行评价：文章基本研究方法与结果与以往研究的方法、结果不同的是，利用血生化与免疫组织化学相结合的研究方法，试图阐明“脊髓损伤后降钙素基因相关肽”对骨代谢的影响，选题和研究方法有一定意义。