△《中国组织工程研究与临床康复》杂志2010年1月4期发表了来自南昌大学第一附属医院骨二科戴闽等作者的文章“金属离子对单核/巨噬细胞细胞活性及其膜上RANK表达的影响”。观察Co2+、Cr3+离子对体外培养小鼠单核/巨噬细胞(RAW264.7)的细胞活性及其膜上RANK表达的影响。

△实验中的操作方法：

单核/巨噬细胞培养：小鼠单核细胞系RAW264.7细胞用含体积分数为10%胎牛血清的不完全RPMI-1640培养基培养，培养基中含L-谷氨酰胺、碳酸氢钠和   80 U/mL青霉素、80 mg/L链霉素。在37 ℃、体积分数为5%的CO2孵箱中培养，每3 d换液1次，当瓶壁细胞达80%汇合度后，用2.5 g/L的胰蛋白酶(含EDTA)消化传代。

CoCl2与CrCl3溶液的制备：将CoCl2粉末与CrCl3粉末溶于无菌注射用水配制成CoCl2溶液和CrCl3溶液，使用前内毒素鳌试剂检测均证实无内毒素。

金属离子对单核/巨噬细胞的干预：将单核/巨噬细胞以2.5×106个/孔密度接种于六孔板，将其放入孵箱过夜。在加入金属离子前，酞酚蓝检测六孔板中单核/巨噬细胞活性>98%。钴和铬离子终浓度参考Fleury等的报道分别为10×10-6和15×10-5。对照组则为单纯细胞培养。

四唑盐(MTT)比色实验：96孔板接种细胞，4 000个/孔，每组7孔，加入四唑盐液(5 g/L)20 μL/孔，37 ℃孵育4 h后吸去上清液，加入DMSO液体150 μL/孔，在摇床上振荡10 min，用酶标仪选择490 nm波长测定各孔吸光度值(A)，其值与细胞数量成正比。

半定量RT-PCR方法测定RANK mRNA的相对表达量：分别在12，24，48 h按RNA提取试剂盒的操作说明书提取各组细胞总RNA，对总RNA进行反转录成cDNA，再对目标cDNA进行扩增(PCR)。小鼠RAW264.7细胞RANK和GAPDH(作为内参)PCR引物根据文献设计。由上海生工生物工程服务有限公司合成。

RANK 的PCR反应条件如下：95 ℃预变性5 min，  94 ℃ 变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min。

内参GAPDH反应条件如下：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共28环，最后72 ℃延伸10 min。

结束后，以DL 600 bp DNA Marker 作为标准，20 g/L琼脂糖凝胶电泳(110 V，60 min)，用全自动凝胶分析系统灰度扫描分析，结果以RANK/GAPDH值表示。

△作者认为：

金属离子诱导单核巨噬细胞RANK的表达变化未见相关报道。RANK是诱导单核/巨噬细胞向破骨细胞分化的重要调节因子，可通过抑制RANK的表达，从而抑制破骨细胞骨溶解为无菌性松动治疗带来新的靶点。前对金属离子对单核/巨噬细胞影响的研究不多见，还没有形成公认的金标准。实验的不足之处在于对RANK的测定只是一个相对表达量，对RANK未进行更多方法的检测，作者将对此进一步研究。                    

△值得他人借鉴的特点：