在各种原因引起的进展性慢性肾脏病中，均可见到肾间质纤维化现象，其病变程度与慢性肾脏病的预后甚为密切，并可作为预测肾功能恶化的一个十分准确的指标。探讨整合素连接激酶、转化生长因子β1及α-平滑肌肌动蛋白与肾间质纤维化中的关系。

    各组处理：模型组大鼠以体积分数为0.1的水合氯醛腹腔麻醉，在近左肾下极处游离并结扎左输尿管；假手术组仅行开腹术游离左输尿管。大鼠于术后1，3，7，14 d麻醉后处死，取其左肾。部分肾组织予体积分数为4%的甲醛固定，石蜡包埋，供常规病理和免疫病理检查；剩下肾组织立即置于液氮冷冻，-80 ℃保存，用于提取总RNA。

    肾小管间质病理损害评分：经苏木精-伊红、PAS和Masson染色，在光镜下选取5个不重叠的200倍视野，依据小管萎缩变性、炎性细胞浸润、间质纤维化等表现的范围作为小管间质损伤程度进行评分。结果由两位病理医师独立观察，取其平均值。间质病变程度的评分 0分：正常或肾小管无明显改变；1分：小管上皮细胞轻度萎缩、变性，纤维组织轻度增生，病变范围<25%；2分：小管上皮细胞中度萎缩、变性、轻度坏死，纤维组织中度增生，病变范围26%~50%；3分:小管上皮细胞萎缩、变性和坏死重，纤维组织增生,病变范围> 50%。

    免疫组织化学病理检查：应用Envision法，常规烤片，逐级脱蜡至水，体积分数为0.03的过氧化氢清除内源性过氧化酶，微波修复15 min，滴加一抗(整合素连接激酶：小鼠抗人单克隆抗体1∶50，α-平滑肌肌动蛋白：兔抗鼠多克隆抗体1∶150，转化生长因子β1兔抗鼠多克隆抗体1∶100)，4 ℃过夜，磷酸盐缓冲液震洗，整合素连接激酶:滴加兔抗小鼠二抗, α-平滑肌肌动、转化生长因子β1滴加羊抗兔二抗，整合素连接激酶37 ℃温箱孵育30 min，α-平滑肌肌动、转化生长因子β1室温孵育15 min，磷酸盐缓冲液冲洗，二氨基联苯胺显色，复染脱水、封固观察。结果由二位病理科医师独立观察染色阳性细胞。高倍镜下选5个小管间质视野观察染色细胞面积，计算其平均值。染色面积：0分为无染色，1分为偶有染色，2分为局灶染色，3分为弥漫染色。

    反转录-聚合酶链反应：Trizol一步法提取肾组织总RNA，用QIAGEN试剂盒扩增聚合酶链反应目的片段。聚合酶链反应反应体积为25 μL。无RNA酶水14.7 μL，Buffer 5.0 μL，Tag酶1.0 μL，dNTP 1.0 μL。

    引物各0.6 μL。50 ℃预变性30 min，95 ℃变性15 min，94 ℃ 30 s、退火56 ℃（整合素连接激酶）或51 ℃ (GAPDH ) 45 s，72 ℃延伸1 min为一个循环，35个循环，72 ℃延伸10 min。取聚合酶链反应产物1 μL，2 g/L琼脂糖凝胶电泳45 min，紫外凝胶分析仪观察、照相，进行半定量分析。

    结果与结论：整合素连接激酶、α-平滑肌肌动蛋白、转化生长因子β1在正常肾组织中表达量极少，但随间质病变的加重，表达量明显增加，与正常组织比差异有非常显著性意义（P < 0.001）。 其与间质纤维化程度呈正相关（r=0.841，0.892，0.854，P < 0.001），在间质中的表达量也成正相关。

    整合素连接激酶、α-平滑肌肌动蛋白、转化生长因子β1 随着间质病变程度的加重而明显增加，说明与肾间质纤维化的形成有密切关系。

    更多内容请见《中国组织工程研究与临床康复》杂志第13卷2009年第2期
 
    杨晓萍，林智峰，张春江，赵瑾，陶林，李洪安. 肾间质纤维化动物模型中整合素连接激酶及相关因子的表达[J].中国组织工程研究与临床康复，2009，13(2):258-262