在胰岛素抵抗的细胞模型中，以游离脂肪酸诱导3T3-L1脂肪细胞和高胰岛素诱导的HepG2肝癌细胞最为常见，对分布最为广泛靶组织骨骼肌的胰岛素抵抗模型报道较少。拟使用L6细胞株建立胰岛素抵抗的骨骼肌细胞模型。

    L6细胞株的诱导分化培养：复苏后的L6细胞在含体积分数为0.1胎牛血清的α-MEM中培养，每隔2 d传代。待细胞长满后，改用含体积分数为0.02胎牛血清的α-MEM中培养，每隔 1 d传代，共培养14 d。

    细胞骨架考马斯亮蓝(R-250)染色：使用考马斯亮蓝(R-250)对诱导后的细胞骨架进行染色，观察L6细胞是否有肌管结构出现。将诱导培养后的细胞用PBS清洗后，以2.5%戊二醛固定30 min，PBS清洗3次；然后加入1% TritonX-100浸泡  10 min，蒸馏水漂洗3次；再加入0.2%考马斯亮蓝(R-250)溶液，染色30 min，用蒸馏水漂洗。在相差显微镜下可见胞质内微丝逐渐明显，背地清亮时立刻终止，漂洗，透明，中性树胶封固。

    胰岛素抵抗模型的建立：①将诱导分化后的细胞按1×106/孔接种于24孔板内，用含体积分数为0.02胎牛血清的α-MEM培养，以L6细胞贴满24孔板的板底为宜。换液后，向各孔内分别加入含体积分数为0.02牛血清白蛋白的α-MEM无血清培养基饥饿培养1，3，5 h，用HBS缓冲液(136 mmol/L NaCl，4.7 mmol/L KCl，1.25 mmol/L MgSO4,  1.2 mmol/L CaCl2)冲洗2遍。②实验组的板孔内加入含1×10-7 mol/L胰岛素的HEPES缓冲液(136 mmol/L NaCl，4.7 mmol/L KCl，1.25 mmol/L MgSO4，1.2 mmol/L CaCl2，0.2%牛血清白蛋白，20 mmol/L HEPES，pH 7.4)孵育1 h；对照组的板孔内加入不含有胰岛素的HEPES缓冲液孵育1 h。弃去上清，用HBS缓冲液冲洗2遍。③每孔内分别加入含0.1 mol/L葡萄糖的HBS缓冲液 100 μL，孵育10 min后取出置于冰板上，快速回收上清。

    上清中葡萄糖浓度测定：采取葡萄糖氧化法检测上清中葡萄糖浓度。使用葡萄糖氧化酶试剂盒进行检测，具体步骤严格按说明书操作。

    结果与结论：诱导前L6细胞未见肌性结构出现，诱导分化后L6细胞内出现肌管结构。使用α-MEM无血清培养基饥饿培养1，3 h，两组上清中葡萄糖浓度基本相似（P > 0.05）；使用α-MEM无血清培养基饥饿培养5 h后，实验组上清中葡萄糖浓度明显高于对照组（P < 0.05）。

    诱导分化成肌后的L6骨骼肌细胞经α-MEM无血清培养基饥饿培养5 h，在胰岛素浓度为1×10-7mol/L的刺激下可形成胰岛素抵抗的骨骼肌细胞模型。

    更多内容请见《中国组织工程研究与临床康复》杂志第13卷2009年第2期 

    杨亮，迟戈，张俊，王良君，刘丽娜，樊淼，刘海东，李伟伟，张健飞，杨菁，隋鸿锦. L6细胞胰岛素抵抗的骨骼肌细胞模型[J].中国组织工程研究与临床康复，2009，13(2):248-251